Gerçekten de kısa bir süre sonra evine döndü ve Besancon Koleji'ne girerek 1840yılında edebiyat bölümünden mezun oldu. Aynı okulda matematik asistanı olarak görev aldı; iki yıl sonra da fen dalından bakaloryasını verdi.

Daha sonra Pasteur, Sorbonne'da kimya profesörü olan J.B. Dumas'ın yanında kimya üzerine çalıştı. 1848 yılında ise Dijon'a fizik profesörü olarak atanan Pasteur, buradan kimya öğrenmek üzere Strasbourg'a gitti. Pasteur'ün böyle birdenbire kürsü değiştirmesinde, rasenik asidin optik özellikleri üzerine yayınladığı ilk orjinal çalışmasının rolü çok büyüktü. Bu ilk zaferi ona Sarbonne Üniversitesi profesörlerinden J.B. Biot'un ömür boyu sürecek dostluğunu ve Strasbourg'daki kürsüyü kazandırdı. Biot, o günlerde çağın bilimadamlarının bir türlü çözemediği ışık konusu üzerine çalışmaktaydı. Pasteur'ün dikkatli gözlemciği sonucu bu sorunun kilit noktası çözülüverdi. Bu işe çok sevinen Biot, Pasteur'ü kolundan yakalayarak, ''Ben hayatım boyunca bilimi o kadar çok sevdim ki, şimdi senin bu buluşun karşısında sevinçten kalbim çarpıyor sevgili çocuğum.'' dedi.

Sorun, yani Pasteur'ün buluşu şuydu: Birbirinin eşi gibi görünen iki asidin polarize edilmiş ışık karşısında değişik reaksiyonlar gösterdiğini açıklamıştı. Asitlerden biri sağa yöneldiği halde diğer asitte bir değişim olmuyordu. Pasteur, ışığa tepki göstermeyen asidin, diğer ile aynı yapıda olduğunu, bileşimlerinde bir değişiklik olmadığını fakat son bileşimlerin ayrı özellikleri yüzünden bambaşka bir şey oluyordu. Sağa yönelen asidin karşısındaki diğer asit büsbütün sola yönelerek sağa yönelen asidi nötralize ediyordu.

Pasteur, Strasbourg'da sık sık ziyaret ettiği Akademi rektörünün kızına aşık oldu ve evlenmemeye yemin etmiş olmasına rağmen1849 yılının 29 Mayıs günü evlendiler. Eşi Marie Pasteur, kocasının çalışmalarını, hatta işine kendinden çok daha fazla zaman ayırmasına rağmen hep destekledi.

1854 yılında Pasteur'e profesörlük ünvanı verildi ve Lille'de kurulan yeni Bilimler Akademisi'nin dekanlığına atandı. Bira endüstrisinin gittikçe gelişmekte olduğu bu şehirde, bilgin bütün dikkatini fermantasyon (mayalanma) olayına verdi. Bir gün Pasteur bir bira fabrikasına davet edildi. Fabrikayı gezdikleri sırada bazı fıçılardan çıkan biranın bazılarına göre oldukça kötü olduğu söylendi. Bilgin fıçılardaki biraları incelemeye koyuldu ve iyi bira fıçılarındaki mayanın şeklinin diğerlerinden farklı olduğunu gördü. İyi birayı meydana getiren mayalar tam yuvarlak mayalardan, diğerleir ise uzunca mayalardan oluşmuştu. Bu gözlem bilgine, mayalanma sırasında fıçıların içine yabancı maddelerin karışarak birayı ekşittiğini düşündürttü.

Bu görüş üzerine araştırmalarını derinleştiren Pasteur, sonunda bozulma olayının, fıçıya karışan yabancı bir maddeden değil de doğrudan doğruya biranın hava ile temas etmesinden ileri geldiğini anladı. Mayalanmayı meydana getiren organizmalar, atmosferdeki diğer organizmalardan meydana gelmişlerdi. Bunun üzerine mikropların havada yaşadığını ispat ederek bu gün bile doğruluğundan hiç bir şey kaybetmemiş bu teoriyi ortaya attı. Bu teoriye göre; canlı organizmalar inorganik maddelerden oluşuyorlardı.

Uzun ve yorucu deneyler sonucu Alp dağlarının tepesindeki havayı filtre eden bilgin, sonunda buluşunu açıkladı: Pastörizasyon, yani mikroplardan arındırma. 1864 yılında yaptığı bu çalışmaların sonucu Pasteur, gününün en büyükü kimyageri olarak tanınmaya başladı. Onun bu büyük buluşunu yaraların tedavisine uygulayan Lord Lister, bu yolla milyonlarca kişiyi septisemi (kan zehirlenmesi) yüzünden ölmekten kurtardı.

1865 yılında Fransız hükümeti Pasteur'den ipek böceklerinde görülen bir hastalığı incelemesini istedi. Hastalık Fransa'nın ipekçilik endüstrisini tehdit ediyordu. Üç yıllık çalışmanın sonunda iki ayrı hastalık basilini tecrit etmeyi başarakrak ipekböceklerini bunlardan korumayı başardı.

O yıllarda yoğun çalışma temposuna dayanamayan Pasteur, hafif bir felç geçirdi. Fakat hastalık yine de çalışmalarını sürdürmesini engellemedi. Paris'e giderek 1880 yılında kimya profesörü olduğu Sorbonne'da araştırmalarına devam etti ve kısa bir süre sonra Fermantasyon konusundaki ünlü etüdünü yayınladı.

Pasteur'ün buluşları daima bir mantık çerçevesi içinde gelişiyordu. Önce bira mayasından havada yaşayan mikropları keşfetti. Sonra Fransa'nınbütün kümes hayvanlarını kırıp geçiren tavuk vebasını incelerken Şarbon hastalığının tedavisini sağlayacak mikrobu buldu. Bu müthiş hastalık yalnız hayvanları değil, insanları da etkiliyordu. Ve sonunda en büyük bşarısı olan kuduzun teşhis ve tedavisini bularak insanlık için en önemli hizmetini yapmış oldu. Kuduz köpekler üzerinde korkusuzca çalışmalarının sonucu bir serum geliştirdi ve serumu uyguladığı hayvanlarda kudurma olmuyordu. Acaba aynı şeyi insanlarda da uygulayabilirmiydi. Kuduz Fransa'da bir kabus halini almıştı, doktorlar buna bir çare bulmak için çırpınıp duruyorlardı. Ama asıl sorun insan hayatını tehlikeye atmayacak dozda serumu bulmaktı. Bir gün hastaneye kuduz bir köpeğin ısırdığı Joseph Meister adında bir çocuk getirildi. Çocuğun hayatından ümit kesilmişti. Kaybedecek şeyi olmayan Pasteur dikkatli bir şekilde hazırladığı serumu üç hafta boyunca çocuğa verdi ve üç hafta sonunda çocuk tamamen iyileşmiş şekilde hastaneden taburcu oldu.

Bu büyük başarı Avrupa'da hızla yayıldı ve adeta bir kahraman oldu. Kendisine verilen üne, şana, şerefe karşılık Pasteur, her zaman sade ve alçakgönüllü bir insan olarak kaldı. Her zaman insanlık için çalıştı ve kendi sağlığını ikinci plana attı. Sonunda yorgun düşen bedeni bu tempoya daha fazla dayanamadı ve 28 Eylül 1895'te yatağında öldü.